慢病毒介导的卵泡抑素抑制下咽癌细胞FaDu增殖和侵袭的作用及影响机制

doi:10.3969/j.issn.2097-0005.2021.07.001

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨卵泡抑素（follistation， FST）在下咽癌（hypopharyngeal carcinoma， HPC）中的生物学作用。

方法

收集2010年8月至2017年12月皖南医学院第一附属医院60例HPC患者，通过定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和免疫组织化学检测FST表达水平。采用qRT-PCR检测其在FaDu以及永生鼻咽上皮细胞系NP-69细胞中的水平。构建特异性沉默FST mRNA的慢病毒载体（shFST）并转染FaDu细胞，观察细胞增殖，流式细胞术分析细胞周期、凋亡和迁移能力，在体接种检测细胞成瘤。此外，使用PathScan应激和凋亡信号蛋白芯片以及qRT-PCR分析FST敲减效应的机制。

结果

与正常组织和NP-69细胞相比，FST在HPC组织和FaDu细胞中的表达更高，且其高表达与肿瘤TNM分期呈正相关； shFST的抑制作用显著降低了FaDu细胞的增殖和迁移能力；FST沉默增加了FaDu细胞的凋亡比例，并使细胞周期停滞在G0/G1期和S期；FST沉默还抑制了体内肿瘤的生长。

结论

FST基因经ERK1/2和caspase信号，参与了HPC的发生发展进程，可能成为HPC的潜在治疗靶标。

关键词: 卵泡抑素, 下咽癌, 迁移, 侵袭, 增殖, 细胞凋亡

Abstract: Objective

To investigat the effect of follistation（FST） expression on hypopharyngeal carcinoma（HPC） tissues and cell lines.

Methods

A total of 60 patients with HPC in the Yijishan Hospital of Wannan Medical College from August 2010 to December 2017 were recruited for this study. Levels of FST mRNA and protein were measured by quantitative polymerase chain reaction （PCR） and immunohistochemistry in HPC tissue samples and by qPCR in the HPC FaDu cells， as well as immortal nasopharyngeal epithelial cell line NP-69 cells. After silencing the FST expression in FaDu cells using lentivirus-mediated siRNA that was specific for FST mRNA， cell proliferation was determined by the Celigo assay. Tumor growth was monitored in nude mice and viability was determined by MTT assay. The ratio of cell cycle arrest and apoptosis was carried out by flow cytometry. The colony formation ability was performed using Giemsa staining. In addition， wound healing assay were performed for analysis of cell motility. Furthermore， the putative mechanism of the effect of FST knockdown was analyzed using PathScan stress and apoptosis signaling array kit， and qPCR.

Results

FST expression was significantly higher in human HPC tissue and FaDu cells when compared with normal tissue and NP-69 cells. A higher expression of FST in HPC samples was positively correlated with advanced tumors. Moreover， FST knockdown by shRNA significantly decreased cell growth， colony formation， and migration. Furthermore， FST silencing increased the cell apoptosis percentage， and arrested cell cycle in the G0/G1 and S phases in FaDu cells. FST silencing also suppressed tumor growth in vivo and might involve upregulating ERK1/2 and caspase signals.

Conclusion

Our results indicate that the FST gene is associated with HPC progression， and may serve as a potential therapeutic target for the treatment of HPC.

Key words: follistatin, hypopharyngeal carcinoma, migration and invasion, proliferation, apoptosis

中图分类号:

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图/表 11

表1 用于定量PCR的引物序列列表

Gene	Primer sequence 5′-3′
SAPK/JNK FP	CCGCTGTCCCTTTGTCTTG
SAPK/JNK RP	GCACATCTATTCTGTTCCATACTACC
Survivin FP	GGCATGGGTGCCCCGACGTTG
Survivin RP	CAGAGGCCTCAATCCATGGCA
Bad FP	CCCAGAGTTTGAGCCGAGTG
Bad RP	GCTGTGCTGCCCAGAGGTT
Akt FP	CGGGCACATCAAGATAACGGAC
Akt RP	TCGTTGTCCTCCAGCACCTCAG
p38 MAPK FP	GCTGAAGATTCTGGATTTTG
p38 MAPK RP	GTTCTTCCAGTCAACAGCTC
ERK1/2 FP	TTACTGCGCTTCAGACATGAGA
ERK1/2 RP	ATCTGTTTCCATGAGGTCCTGT
CAPS3 FP	CTGGAAAACCCAAACTTTTCATTA
CAPS3 RP	GCCAGGAAA AGTAACCAGGTGC
CAPS7 FP	CGGTCCTCGTTTGTACCGTC
CAPS7 RP	CGCCCATACCTGTCACTTTATCA
GAPDH FP	TGACTTCAACAGCGACACCCA
GAPDH RP	CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA

图1 卵泡抑素在下咽癌样品和细胞系中的表达水平A.来自HPC患者的临床样本中FST mRNA表达；B. FST mRNA在NP-69和FaDu细胞中的表达；C.蛋白质印迹分析显示了FST在HPC细胞系中的表达。GAPDH用作内部对照。**P < 0.001。

图2 免疫组化检测FST在下咽癌样本中的表达（×40）

表2 FST表达与下咽癌临床病理特征的关系

临床特征	例数	FST表达		χ²	P
临床特征	例数	低	高	χ²	P
性别				1.610	0.205
男	31	9	22
女	29	13	16
年龄（岁）				0.116	0.734
≤ 60	31	12	19
> 60	29	10	19
组织学分级				2.297	0.130
高	20	10	10
中 + 差	40	12	28
TNM分期				4.318	0.038
0/Ⅰ	24	5	19
Ⅱ/Ⅲ	36	17	19
淋巴结转移				5.813	0.016
否	12	8	4
是	48	14	34

图3 卵泡抑素敲减在下咽癌细胞系中的表达分析A. shFST或shCtrl慢病毒感染后5天，与FaDu阴性对照细胞相比，FaDu FST-siRNA敲减细胞中FST mRNA表达显著降低（**P < 0.01）；B.蛋白印迹分析了Mock、shCtrl和shFST组中FST蛋白的表达。GAPDH用作内参。**P < 0.001。

表3 FST敲减对FaDu细胞的细胞周期的影响（n = 3）

分组		均数	标准差	F	P
G0/G1	Mock	45.66	0.48	10.88	0.010
	shCtrl	47.57	0.80
	shFST	48.47	0.91
S	Mock	23.66	1.05	237.32	<0.001
	shCtrl	25.05	0.63
	shFST	38.51	1.03
G2/M	Mock	20.75	0.66	58.69	<0.001
	shCtrl	16.77	0.75
	shFST	13.44	1.03

表4 FST敲减对FaDu细胞凋亡的影响（n = 3）

分组	均数	标准差	F	P
Mock	5.82	0.12	1 078.77	<0.001
shCtrl	4.74	0.15
shFST	15.40	0.50

表5 FST敲减对FaDu细胞克隆形成的影响（n = 3）

分组	均数	标准差	F	P
Mock	142.33	4.51	189.20	<0.001
shCtrl	115.00	3.00
shFST	69.00	6.00

图4 FST敲减可抑制FaDu细胞的迁移A. shFST慢病毒转染的FaDu细胞划痕试验的代表性图片；B.转染shFST慢病毒的FaDu细胞的划痕试验的定量结果。** P < 0.001。

图5 FST敲减抑制了在体异种移植瘤的生长A.注射5周后的FaDu异体种植瘤大小；B.种植瘤的平均重量，n = 10；C.种植瘤的体积变化。n = 10。

图6 FST敲减对FaDu细胞中细胞增殖相关信号分子的影响A.抗体芯片中相关分子的表达；B. qPCR检测差异表达的信号分子。** P < 0.001 vs. shCtrl组。

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