干扰UCP2保护H9C2心肌细胞免受缺氧诱导的细胞凋亡并抑制细胞自噬

doi:10.3969/j.issn.2097-0005.2021.09.003

摘要/Abstract

摘要： 目的

研究干扰解偶联蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）表达对缺氧诱导的细胞凋亡及自噬的影响。

方法

通过RT-qPCR检测缺氧后H9C2心肌细胞UCP2表达水平，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）荧光实验检测干扰UCP2对细胞内ROS水平的影响，通过流式细胞实验检测细胞凋亡率，通过蛋白免疫印迹实验进一步检测干扰UCP2对cleaved-caspase 3的影响，并通过ELISA检测细胞损伤相关因子：乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），最后检测细胞自噬相关因子：膜型LC3/胞浆型LC3（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）、自噬基因Beclin-1以及p62的表达水平。

结果

缺氧环境下H9C2细胞中UCP2的表达量明显升高，干扰UCP2表达可以降低缺氧引起的细胞内ROS水平升高。干扰UCP2表达可以降低缺氧环境下H9C2细胞凋亡率，并且降低LDH、CK、IL-6和TNF-α的表达水平。在蛋白免疫印迹实验中，干扰UCP2表达可降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表达，并增加p62的表达水平。

结论

干扰UCP2可降低缺氧引起的细胞内ROS水平，并抑制缺氧引起的细胞凋亡及自噬。

关键词: UCP2, H9C2, 细胞凋亡, 细胞自噬, ROS

Abstract: Objective

To study the effect of interfering uncoupling protein 2 expression on apoptosis and autophagy induced by hypoxia.

Methods

The expressions of UCP2 in H9C2 myocardial cells after hypoxia were detected by RT-q PCR. Reactive oxygen species （ROS） fluorescence assay was used to detect the effect of UCP2 interference on intracellular ROS level. The apoptotic rate was detected by flow cytometry. The effects of UCP2 interference on cleaved-caspase 3 were further detected by Western blotting. The cell damage related factors were detected by ELISA： lactate dehydrogenase （LDH）， creatine kinase （CK）， interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-alpha （TNF-a）. The expression levels of membrane LC3/cytoplasmic LC3 （LC3-?Ⅱ/LC3-?Ⅰ）， autophagy gene Beclin-1 and p62 were detected.

Results

The expression of UCP2 was significantly increased in H9C2 cells under hypoxia. Interference with UCP2 expression could reduce the increase of ROS level in H9C2 cells induced by hypoxia. Interference with UCP2 expression could reduce the apoptotic rate of H9C2 cells and the expression levels of LDH， CK， IL-6 and TNF-alpha in hypoxic environment. In Western blotting， interfering with UCP2 expression could decrease the expression of LC3-?Ⅱ/LC3-?Ⅰ and Beclin-1， and increase the expression of p62.

Conclusion

Interference with UCP2 can reduce ROS level in cells induced by hypoxia， and inhibit apoptosis and autophagy induced by hypoxia.

Key words: UCP2, H9C2, apoptosis, autophagy, ROS

中图分类号:

R329

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图/表 5

图1 缺氧环境下UCP2在心肌细胞H9C2中的表达A. UCP2在H9C2细胞系中的表达水平；B. shRNA-UCP2的转染效率，转染后呈红色荧光；C. 蛋白免疫印迹实验结果，转染后UCP2表达水平降低；D. 和蛋白质免疫印迹实验的统计（xˉ±s，###P < 0.001 vsCon；**P < 0.01 vsNC）。

图2 干扰UCP2对缺氧环境下心肌细胞H9C2细胞内ROS含量的影响A. ROS荧光强度示意图；B. ROS荧光强度统计图（xˉ±s，###P < 0.001 vsCon；**P < 0.01 vsNC）。

图3 干扰UCP2对缺氧环境下心肌细胞H9C2细胞凋亡的影响A.流式细胞术实验细胞凋亡示意图； B.凋亡率统计图（xˉ±s，###P <0.001 vs Con；**P <0.01 vsNC）。

图4 干扰UCP2对缺氧环境下心肌细胞H9C2细胞损伤及炎症水平的影响A. cleaved caspase-3 表达水平的免疫印迹结果；B.蛋白质印迹统计图；C. CK含量；D. LDH含量；E. IL-6含量；F. TNF-α含量（xˉ±s，###P < 0.001 vsCon；**P < 0.01 vsNC）。

图5 干扰UCP2对缺氧环境下心肌细胞H9C2细胞自噬的影响A.　LC3-II/LC3-I、Beclin-1和p62蛋白表达水平； B、C、D：统计结果（xˉ±s，##P <0.001 vs Con；**P <0.01 vsNC）。

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