基于Golden Gate高效构建psiCHECK双荧光素酶报告基因的方法及应用

betway必威登陆网址（betway.com ）学报››2023,Vol. 44››Issue (3): 180-185.DOI:10.3969/j.issn.2097-0005.2023.03.004

基于Golden Gate高效构建psiCHECK双荧光素酶报告基因的方法及应用

杜雅婷¹^,²(), 于文君³, 李燕², 付元磊¹^,², 孙考祥¹()

^1.烟台大学药学院，山东烟台 264000
^2.烟台药物研究所，山东烟台 264000
^3.烟台新药创制山东省实验室，中科环渤海（烟台）药物高等研究院，山东烟台 264000

收稿日期:2022-11-18出版日期:2023-04-24发布日期:2023-04-24
通讯作者:孙考祥
作者简介:杜雅婷，硕士研究生，研究方向：药剂学，E-mail：dyt17856518601@163.com。
基金资助:
中科环渤海（烟台）药物高等研究院自主部署项目(LX211001)

Efficient construction and application of psiCHECK dual-luciferase reporter gene based on Golden Gate

Yating DU¹^,²(), Wenjun YU³, Yan LI², Yuanlei FU¹^,², Kaoxiang SUN¹()

^1.School of Pharmacy，Yantai University，Yantai 264000，China
^2.Yantai Institute of Materia Medica，Yantai 264000，China
^3.Shandong Laboratory of Yantai Drug Discovery，Bohai Rim Advanced Research Institute for Drug Discovery，Yantai 264000，China

Received:2022-11-18Online:2023-04-24Published:2023-04-24
Contact:Kaoxiang SUN

摘要/Abstract

摘要：

目的基于Golden Gate技术构建psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体，并探讨其能否用于RNA干扰（RNA interference， RNAi）药物筛选。方法通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增CcdB致死基因、氯霉素基因与Golden Gate组装所需的BsmBI酶切位点，将其克隆至psiCHECK-2载体，构建出重组载体psiCHECK-CcdB。利用2种大肠杆菌DB3.1与DH5α对该载体的致死效率进行检测，选用1 387 bp大小的外源片段克隆至psiCHECK-CcdB载体，检测其连接效率，并验证重组载体能否发挥双荧光素酶报告系统功能，监测目的基因的表达变化。结果菌落PCR以及测序鉴定psiCHECK-CcdB重组质粒构建成功，该质粒可有效致死无法耐受CcdB毒素的大肠杆菌DH5α菌株，在DB3.1菌株中正常生长。采用Golden Gate的方法可将外源片段简单快速克隆至psiCHECK-CcdB载体中，连接效率显著提高且低背景克隆。通过测定双荧光素酶表达强度，证实了小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）靶向性结合目的基因可显著下调荧光素酶的表达，成功发挥双荧光素酶报告基因功能。结论本研究成功构建了psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体，应用Golden Gate组装技术，简化了实验操作流程，降低了实验成本，具备较高的阳性克隆率与多片段一次性组装的潜力，在RNAi药物筛选领域应用前景广阔。

关键词:Golden Gate,CcdB基因,双荧光素酶报告基因,分子克隆,RNAi药物筛选

Abstract:

ObjectiveTo construct a dual-luciferase reporting system psiCHECK-CcdB for RNAinterference （RNAi） drug screeningbased on Golden Gate cloning （seamless cloning） technology， ed.MethodsThe BsmBI digestion sites needed for assembly of Golden Gate， the CcdB lethal gene and chloramphenicol gene was amplified by PCR and cloned into psiCHECK-2 vector to construct vector psiCHECK-CcdB. The lethal efficiency of the vector was detected by two kinds of E. coli DB3.1 and DH5α. The exogenous fragment of 1387 bp was cloned into psiCHECK-CcdB vector to detect its ligation efficiency， and investigated whether the psiCHECK-CcdB recombinant vector could be used as a dual-luciferase reporter system to monitor changes in target gene expression.ResultsThe recombinant plasmid psiCHECK-CcdB was successfully constructed by colony PCR and sequencing. The plasmid had significant lethal effect on E. coli DH5α strain which was not tolerant to CcdB toxic protein， and could grow normally in DB3.1 strain. Exogenous fragment could be easily and quickly cloned into the psiCHECK CcdB vector using the Golden Gate method with high ligation efficiency and low background cloning. By measuring the intensity of dual-luciferase expression， it was confirmed that the small interfering RNA（siRNA） sequence binded specifically to the target gene significantly reduced the expression of luciferase and successfully exerted the function of the dual-luciferase reporter gene.ConclusionThe recombinant double luciferase reporter vector psiCHECK-CcdB is successfully constructed. The application of Golden Gate assembly technology simplifies experimental operations， reduces experimental costs， has high positive clone rates and the potential to assemble multiple fragments at once， making it a promising candidate in the field of RNAi drug screening.

Key words:Golden Gate,CcdB gene,dual-luciferase reporter gene,molecular cloning,RNAi drug screening

杜雅婷, 于文君, 李燕, 付元磊, 孙考祥. 基于Golden Gate高效构建psiCHECK双荧光素酶报告基因的方法及应用[J]. betway必威登陆网址（betway.com ）学报, 2023, 44(3): 180-185.

Yating DU, Wenjun YU, Yan LI, Yuanlei FU, Kaoxiang SUN. Efficient construction and application of psiCHECK dual-luciferase reporter gene based on Golden Gate[J]. Journal of Shandong First Medical Unversity & Shandong Academy of Medical Sciences, 2023, 44(3): 180-185.

图/表9

引物名称	引物序列（5’-3’）	片段大小/bp
CcdB-CM-F	CCGCTCGAGGGAGCGAGACGCACGAGGCTTAC	1 476
CcdB-CM-R	AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGGAGAGACGGAATTCAAAAAAAAGCG
psiCHECK-CX-F1	GGAGCTAAGAAGTTCCCTAACACCG	745
psiCHECK-CX-R1	CACCCAGGGATTGGCTGACACGAAAAACATATTCTC
psiCHECK-CX-F1	GGAGCTAAGAAGTTCCCTAACACCG	1 673
psiCHECK-CX-R2	CGCGTCAGACAAACCCTAACCACCG

引物名称	引物序列（5’-3’）	片段大小/bp
CcdB-CM-F	CCGCTCGAGGGAGCGAGACGCACGAGGCTTAC	1 476
CcdB-CM-R	AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGGAGAGACGGAATTCAAAAAAAAGCG
psiCHECK-CX-F1	GGAGCTAAGAAGTTCCCTAACACCG	745
psiCHECK-CX-R1	CACCCAGGGATTGGCTGACACGAAAAACATATTCTC
psiCHECK-CX-F1	GGAGCTAAGAAGTTCCCTAACACCG	1 673
psiCHECK-CX-R2	CGCGTCAGACAAACCCTAACCACCG

siRNA序列	SS	AS（5’-3’）
F2	CUUUUUACAGCCAACUUUUCU	AGAAAAGUUGGCUGUAAAAAG
F3	AUGGAACUUUUUCCGUUAUCA	UGAUAACGGAAAAAGUUCCAU
F16	GCAGAAUGACUUUUAUUGAGC	GCUCAAUAAAAGUCAUUCUGC
无序	UUCUCCGAACGUGUCACGUUU	ACGUGACACGUUCGGAGAAUU

siRNA序列	SS	AS（5’-3’）
F2	CUUUUUACAGCCAACUUUUCU	AGAAAAGUUGGCUGUAAAAAG
F3	AUGGAACUUUUUCCGUUAUCA	UGAUAACGGAAAAAGUUCCAU
F16	GCAGAAUGACUUUUAUUGAGC	GCUCAAUAAAAGUCAUUCUGC
无序	UUCUCCGAACGUGUCACGUUU	ACGUGACACGUUCGGAGAAUU

组别	siRNA F2	siRNA F3	siRNA F16
siRNA转染组	0.09 ± 0.04	0.11 ± 0.01	0.04 ± 0.02
无序siRNA组	1.00 ± 0.05	1.00 ± 0.05	1.00 ± 0.05
t	26.35	29.95	30.22
P	< 0.001	< 0.001	< 0.001

组别	siRNA F2	siRNA F3	siRNA F16
siRNA转染组	0.09 ± 0.04	0.11 ± 0.01	0.04 ± 0.02
无序siRNA组	1.00 ± 0.05	1.00 ± 0.05	1.00 ± 0.05
t	26.35	29.95	30.22
P	< 0.001	< 0.001	< 0.001

参考文献21

1	Solberg N， Krauss S. Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment［J］. Methods Mol Biol， 2013， 977： 65.
2	Kisly I， Kattel C， Remme J， et al. Luciferase-based reporter system forin vitroevaluation of elongation rate and processivity of ribosomes［J］. Nucleic Acids Res， 2021， 49（10）： e59.
3	Yokoi T， Nabe T， Ishizuka C， et al. A luciferase reporter assay for ecdysone agonists using HEK293T cells［J］. Biosci Biotechnol Biochem， 2022， 86（11）： 1490.
4	Zhu L， Liu Y， Wang A， et al. Nuclear factor kappa B promotes ferritin heavy chain expression inBombyx moriin response toB.morinucleopolyhedrovirus infection［J］. Int J Mol Sci， 2022， 23（18）： 10380.
5	Goonawardane N， Upstone L， Harris M， et al. Identification of host factors differentially induced by clinically diverse strains of tick-borne encephalitis virus［J］. J Virol， 2022， 96（18）： e0081822.
6	Xu C， Qi X. MiR-10b inhibits migration and invasion of pancreatic ductal adenocarcinoma via regulating E2F7［J］. J Clin Lab Anal， 2020， 34（10）： e23442.
7	Zhang Y， Zhou J， Liu S， et al.MAPK1 is regulated by LOC102188416/miR-143-3p axis in dairy goat mammary epithelial cells［J］. Genes （Basel）， 2022， 13（6）： 1013.
8	Banaei-Esfahani A， Moazzeni H， Nosar PN， et al. MicroRNAs that target RGS5［J］. Iran J Basic Med Sci， 2015， 18（2）： 108.
9	张玫，何訸，宋昊岚，等. 双荧光素酶报告基因系统鉴定has-miR-577和has-miR-583对FGF-21基因的靶向调控［J］. 四川大学学报（医学版）， 2016， 47（6）： 916.
10	Li N， Sun Y， Fu Y， et al. RNA drug delivery using biogenic nanovehicles for cancer therapy［J］. Front Pharmacol， 2021， 12： 734443.
11	Engler C， Marillonnet S. Golden Gate cloning［J］. Methods Mol Biol， 2014， 1116： 119.
12	Engler C， Kandzia R， Marillonnet S. A one pot， one step， precision cloning method with high throughput capability［J］. PLoS One， 2008， 3（11）： e3647.
13	周玉亭，曹建斌. α-互补与蓝白斑筛选机制的探究［J］. 生物技术通报， 2010（8）： 218.
14	Yazynin SA， Deyev SM， Jucovic M， et al. A plasmid vector with positive selection and directional cloning based on a conditionally lethal gene［J］. Gene， 1996， 169（1）： 131.
15	Murakami Y， Futamata R， Horibe T， et al. CRISPR/Cas9 nickase-mediated efficient and seamless knock-in of lethal genes in the medaka fishOryzias latipes［J］. Dev Growth Differ， 2020， 62（9）： 554.
16	Schlieper D， Von Wilcken-Bergmann B， Schmidt M， et al. A positive selection vector for cloning of long polymerase chain reaction fragments based on a lethal mutant of the crp gene ofEscherichia coli［J］. Anal Biochem， 1998， 257（2）： 203.
17	Miyazaki K. Lethal ccdB gene-based zero-background vector for construction of shotgun libraries［J］. J Biosci Bioeng， 2010， 110（3）： 372.
18	Van Melderen L. Molecular interactions of the CcdB poison with its bacterial target， the DNA gyrase［J］. Int J Med Microbiol， 2002， 291（6/7）： 537.
19	Dao-Thi MH， Van Melderen L， De Genst E， et al. Molecular basis of gyrase poisoning by the addiction toxin CcdB［J］. J Mol Biol， 2005， 348（5）： 1091.
20	党会杰，刘秦，许文茸，等. 一种快速高效的基于CcdB致死基因和SmaⅠ酶切位点的克隆体系构建［J］. 基因组学与应用生物学， 2017， 36（7）： 2874.
21	耿晓姗，刘秦，党会杰，等. 利用毒素蛋白基因ccdB构建高效低背景T-载体［J］. 热带生物学报， 2016， 7（2）： 232.