肠道病毒71型 VP1蛋白原核表达及在高通量抗体筛选中的应用

betway必威登陆网址（betway.com ）学报››2021,Vol. 42››Issue (9): 641-644.DOI:10.3969/j.issn.2097-0005.2021.09.001

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肠道病毒71型 VP1蛋白原核表达及在高通量抗体筛选中的应用

崔珂(), 孔亚茹(), 马传敏(), 张振杰, 史卫峰, 全传松()

betway必威登陆网址（betway.com ）基础医学院病原生物学系，山东济南 250014

收稿日期:2021-03-15出版日期:2021-09-25发布日期:2021-10-13
通讯作者:全传松
作者简介:崔珂，在读本科生，E-mail：ck000103@126.com
孔亚茹，在读本科生，E-mail：17861523220@163.com
崔珂，在读本科生，E-mail：ck000103@126.com
基金资助:
山东省医药卫生科技发展计划(2019WS395);山东省大学生创新创业训练项目(S201910439089)

Prokaryotic expression of enterovirus 71 type VP1 protein and its application in high throughput antibody screening

Ke Cui(), Yaru Kong(), Chuanmin Ma(), Zhenjie Zhang, Weifeng Shi, Chuansong Quan()

Department of Pathogen Biology，School of Basic Medical Sciences，Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250014，China

Received:2021-03-15Online:2021-09-25Published:2021-10-13
Contact:Chuansong Quan

摘要/Abstract

摘要： 目的

肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是引起重症手足口病的主要病原体，目前缺少有效的抗病毒药物。本研究利用EV71 VP1蛋白作为抗原，筛选免疫小鼠脾脏特异性表达EV71抗体的B细胞。

方法

将EV71 VP1 基因进行密码子优化，构建至pET-21a（+）表达载体，并转化到大肠埃希菌BL21-DE3，优化蛋白表达和复性条件，经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达，并检测其抗原性；以纯化蛋白为抗原，通过流式细胞术对灭活病毒免疫小鼠的B淋巴细胞进行分选，用于单克隆抗体的制备。

结果

EV71 VP1基因在大肠埃希菌中以包涵体形式稳定表达，纯化复性后的蛋白具有良好的免疫原性；利用表达的VP1蛋白从免疫和未免疫的昆明小鼠脾脏筛选出能够特异性表达EV71抗体的B细胞，两者数量差异具有统计学意义。

结论

成功获得免疫原性良好的EV71 VP1重组蛋白?，与流式细胞术结合可用于EV71特异B细胞的检测和分选。

关键词:肠道病毒71型,VP1,蛋白表达,抗体筛选

Abstract: Objective

Enterovirus 71 （EV71） is the main pathogen causing severe hand， foot and mouth disease （HFMD）， however， there is no effective antiviral drugs available. To screen mouse specific B cells expressing antibodies against EV71 by using EV71 VP1 protein as an antigen.

Method

The codon-optimized EV71 VP1 gene was cloned into pET-21a （+） expression vector and transformed intoE. coli.BL21-DE3. By optimizing protein expression and renaturation conditions， the expressed protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blot and its antigenicity was also tested. Using purified protein as antigen， B lymphocytes of mice immunized with inactivated， and EV71 viruses were sorted by flow cytometry for the preparation of monoclonal antibody.

Results

The EV71 VP1 gene was stably expressed in the form of inclusion body in theE. coli. The purified protein showed good immunogenicity， and there was a significant difference between the B cells of immunized and unimmunized BALB/c mice when screened using the expressed protein.

Conclusion

The recombinant EV71 VP1 protein with good immunogenicity is successfully obtained and combined with flow cytometry， it can be used for detection and sorting of EV71 specific B cells.

Key words:enterovirus 71,VP1,prokaryotic expression,antibody screening

中图分类号:

R373

崔珂, 孔亚茹, 马传敏, 张振杰, 史卫峰, 全传松. 肠道病毒71型 VP1蛋白原核表达及在高通量抗体筛选中的应用[J]. betway必威登陆网址（betway.com ）学报, 2021, 42(9): 641-644.

Ke Cui, Yaru Kong, Chuanmin Ma, Zhenjie Zhang, Weifeng Shi, Chuansong Quan. Prokaryotic expression of enterovirus 71 type VP1 protein and its application in high throughput antibody screening[J]. Journal of Shandong First Medical Unversity & Shandong Academy of Medical Sciences, 2021, 42(9): 641-644.

图/表5

图1限制酶切电泳结果M：DNA 分子质量标准（DL10，000）； 1：经Scal 和 Xhol双酶切； 2：未被酶切。

图2包涵体SDS-PAGE分析M：预染蛋白质相对分子质量标准； 1：超声破碎上清； 2：包涵体溶液；3：正常细菌。

图3纯化蛋白收集的峰图和鉴定M：预染蛋白质相对分子质量标准；1：纯化蛋白。

图4重组蛋白抗原性分析A.一抗为6 × His抗体；B.一抗为免疫小鼠血清。M：预染蛋白质相对分子质量标准；1：EV71-VP1蛋白；2：正常细菌。

图5EV71 VP1特异性B细胞的检测A.免疫组与PBS组EV71 VP1特异性B细胞流式圈门策略图，VP1特异性B细胞（CD19+Anti-his+）；B.免疫组与PBS组EV71 VP1特异性B细胞与AF-700染色细胞比例分析，免疫组：用灭活EV71病毒免疫小鼠获得的脾脏细胞，PBS组：用PBS免疫小鼠获得的脾脏细胞。

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