质粒DNA实验室规模化制备工艺

摘要/Abstract

摘要：

目的探索实验室规模生产质粒DNA（plasmid DNA，pDNA）的制备工艺。方法选用质粒pEGFP-N1E.coliStbl3菌株，用最陡爬坡试验（plackett-burman，PB）筛选出影响质粒产量最显著因素，响应面法优化重组菌高产发酵条件。采用碱裂解，浓缩质粒，通过凝胶、亲和、离子等层析分离纯化pDNA，并对所纯化的pDNA进行质量评价。结果用PB试验和响应面试验设计筛选出的关键因素是：酵母提取物20 g/L，甘油6 g/L，接种物浓度吸光度（optical density，OD） = 0.014。在最佳条件下进行3次平行发酵，生物量OD 600达28.07 ± 2.01，质粒产量（21.34 ± 1.31） mg/L。pDNA纯度（A260 nm/A280 nm）为1.91 ± 0.02。内毒素含量小于0.005 EU/g DNA；几乎检测不到蛋白质及细菌基因组DNA残留，达到相关质量标准。结论本研究采用的制备工艺可生产出高质量的pDNA。

关键词:质粒DNA,响应面,实验室规模发酵,纯化,质量评价

Abstract:

ObjectiveTo explore the preparation technology of plasmid DNA （pDNA） in laboratory scale production.MethodsPlasmid pEGFP-N1E.coliStbl3 strain was selected， and the most significant factors affecting plasmid yield were screened by plackett-burman test， and the high yield fermentation conditions of recombinant bacteria were optimized by response surface method. The plasmid DNA was isolated and purified by alkaline lysis， concentration of plasmid， gel， affinity and ion chromatography， and the quality of purified pDNA was evaluated.ResultsThe key factors selected by steepest climbing test and response surface test design were yeast extract 20 g/L， glycerol 6 g/L and inoculum concentration OD = 0.014. Under the optimum conditions， the biomass OD 600 and plasmid yield were （28.07 ± 2.01） and （21.34 ± 1.31） mg/L respectively. The purity of plasmid DNA （A260 nm/A280 nm） was （1.91 ± 0.02）. When the content of endotoxin was less than that of 0.005 EU/g DNA； there was almost no protein or bacterial genomic DNA residue. All the indicators met the relevant quality standards.ConclusionThe high quality pDNA can be produced by the preparation process.

Key words:plasmid DNA,response surface methodology,lab-scale fermentation,purification,quality evaluation

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图/表11

符号编码	因子	低值（-1）	高值（+ 1）
A（g/L）	蛋白胨	10.00	15.00
B（g/L）	酵母抽提物	16.00	24.00
C（g/L）	抗生素	0.05	0.10
D（g/L）	甘油	5.00	7.50
E（OD）	接种浓度	0.01	0.02
F（℃）	温度	30.00	37.00
G（v：v）	培养液/摇瓶体积比	0.1	0.2
H-K	Dummy1-4	-1	1

符号编码	因子	低值（-1）	高值（+ 1）
A（g/L）	蛋白胨	10.00	15.00
B（g/L）	酵母抽提物	16.00	24.00
C（g/L）	抗生素	0.05	0.10
D（g/L）	甘油	5.00	7.50
E（OD）	接种浓度	0.01	0.02
F（℃）	温度	30.00	37.00
G（v：v）	培养液/摇瓶体积比	0.1	0.2
H-K	Dummy1-4	-1	1

运行	A	B	C	D	E	F	G	响应值质粒容积产率/（mg/L）
1	-1	1	-1	-1	1	1	-1	16.472
2	1	1	-1	1	-1	-1	1	0.292
3	1	-1	-1	-1	1	1	1	27.726
4	1	-1	1	-1	-1	-1	-1	0.082
5	-1	1	1	-1	-1	1	1	3.537
6	-1	-1	-1	1	1	-1	1	0.122
7	-1	1	1	1	1	-1	-1	0.002
8	1	1	-1	1	-1	1	-1	2.837
9	-1	-1	-1	-1	-1	-1	-1	1.876
10	1	1	1	-1	1	-1	1	0.064
11	-1	-1	1	1	-1	1	1	0.992
12	1	-1	1	1	1	1	-1	1.834

运行	A	B	C	D	E	F	G	响应值质粒容积产率/（mg/L）
1	-1	1	-1	-1	1	1	-1	16.472
2	1	1	-1	1	-1	-1	1	0.292
3	1	-1	-1	-1	1	1	1	27.726
4	1	-1	1	-1	-1	-1	-1	0.082
5	-1	1	1	-1	-1	1	1	3.537
6	-1	-1	-1	1	1	-1	1	0.122
7	-1	1	1	1	1	-1	-1	0.002
8	1	1	-1	1	-1	1	-1	2.837
9	-1	-1	-1	-1	-1	-1	-1	1.876
10	1	1	1	-1	1	-1	1	0.064
11	-1	-1	1	1	-1	1	1	0.992
12	1	-1	1	1	1	1	-1	1.834

模型项	贡献度/%	平方和	自由度	均方根	F	P
模型		305 000.00	6	50 903.75	14.07	0.005
B-酵母提取物	5.376	18 979.67	1	18 979.67	5.25	0.071
C-抗生素	17.306	61 099.86	1	61 099.86	16.89	0.009
D-甘油	28.694	101 000.00	1	101 000.00	28.00	0.003
E-接种浓度	22.363	78 953.29	1	78 953.29	21.83	0.006
F-温度	9.229	32 582.41	1	32 582.41	9.01	0.030
AC	13.183	46 542.36	1	46 542.36	12.87	0.016

模型项	贡献度/%	平方和	自由度	均方根	F	P
模型		305 000.00	6	50 903.75	14.07	0.005
B-酵母提取物	5.376	18 979.67	1	18 979.67	5.25	0.071
C-抗生素	17.306	61 099.86	1	61 099.86	16.89	0.009
D-甘油	28.694	101 000.00	1	101 000.00	28.00	0.003
E-接种浓度	22.363	78 953.29	1	78 953.29	21.83	0.006
F-温度	9.229	32 582.41	1	32 582.41	9.01	0.030
AC	13.183	46 542.36	1	46 542.36	12.87	0.016

编码	接种浓度A（OD）	甘油B/（g/L）	酵母提取物C（g/L）
-1	0.01	5	16
0	0.015	6.25	20
1	0.02	7.5	24

编码	接种浓度A（OD）	甘油B/（g/L）	酵母提取物C（g/L）
-1	0.01	5	16
0	0.015	6.25	20
1	0.02	7.5	24

序号	接种浓度A（OD600）	甘油B /（g/L）	酵母提取物C/（g/L）	质粒容积产率R/（mg/L）
1	0	-1	1	16.84
2	0	-1	-1	17.215
3	0	1	1	17.53
4	0	1	-1	17.33
5	0	0	0	20.095
6	1	-1	0	17.765
7	0	0	0	20.19
8	1	0	1	17.965
9	-1	1	0	18.605
10	0	0	0	19.915
11	-1	0	-1	18.615
12	0	0	0	20.06
13	1	0	-1	17.065
14	-1	0	1	17.535
15	0	0	0	19.98
16	1	1	0	17.34
17	-1	-1	0	17.93

序号	接种浓度A（OD600）	甘油B /（g/L）	酵母提取物C/（g/L）	质粒容积产率R/（mg/L）
1	0	-1	1	16.84
2	0	-1	-1	17.215
3	0	1	1	17.53
4	0	1	-1	17.33
5	0	0	0	20.095
6	1	-1	0	17.765
7	0	0	0	20.19
8	1	0	1	17.965
9	-1	1	0	18.605
10	0	0	0	19.915
11	-1	0	-1	18.615
12	0	0	0	20.06
13	1	0	-1	17.065
14	-1	0	1	17.535
15	0	0	0	19.98
16	1	1	0	17.34
17	-1	-1	0	17.93

方差来源	平方和	自由度	方差	F	P
合计	25.12	16
回归模型	24.40	9	2.71	26.29	< 0.001
A	0.81	1	0.81	7.88	0.026
B	0.37	1	0.37	3.63	0.096
C	0.01	1	0.01	0.01	0.767
AB	0.30	1	0.30	2.93	0.131
AC	0.98	1	0.98	9.50	0.018
BC	0.06	1	0.063	0.61	0.462
A²	1.87	1	1.87	18.14	0.004
B²	8.27	1	8.27	80.20	< 0.001
C²	9.68	1	9.68	93.90	< 0.001
残差	0.72	7	0.10
失拟项	0.20	3	0.067	0.52	0.692
纯误差	0.52	4	0.13

方差来源	平方和	自由度	方差	F	P
合计	25.12	16
回归模型	24.40	9	2.71	26.29	< 0.001
A	0.81	1	0.81	7.88	0.026
B	0.37	1	0.37	3.63	0.096
C	0.01	1	0.01	0.01	0.767
AB	0.30	1	0.30	2.93	0.131
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BC	0.06	1	0.063	0.61	0.462
A²	1.87	1	1.87	18.14	0.004
B²	8.27	1	8.27	80.20	< 0.001
C²	9.68	1	9.68	93.90	< 0.001
残差	0.72	7	0.10
失拟项	0.20	3	0.067	0.52	0.692
纯误差	0.52	4	0.13

方差来源	平方和	自由度	方差	F	P
回归模型	9 513.70	9	1 057.08	194.01	< 0.001
A	325.12	1	325.12	59.67	< 0.001
B	55.65	1	55.65	10.21	0.015
C	6.30	1	6.30	1.16	0.318
AB	121.00	1	121.00	22.21	0.002
AC	392.04	1	392.04	71.95	< 0.001
BC	33.06	1	33.06	6.07	0.043
A²	1 040.17	1	1 040.17	190.91	< 0.001
B²	3 079.14	1	3 079.14	565.14	< 0.001
C²	3 625.19	1	3 625.19	665.36	< 0.001
残差	38.14	7	5.45
失拟项	20.21	3	6.74	1.50	0.342
纯误差	17.93	4	4.48

方差来源	平方和	自由度	方差	F	P
回归模型	9 513.70	9	1 057.08	194.01	< 0.001
A	325.12	1	325.12	59.67	< 0.001
B	55.65	1	55.65	10.21	0.015
C	6.30	1	6.30	1.16	0.318
AB	121.00	1	121.00	22.21	0.002
AC	392.04	1	392.04	71.95	< 0.001
BC	33.06	1	33.06	6.07	0.043
A²	1 040.17	1	1 040.17	190.91	< 0.001
B²	3 079.14	1	3 079.14	565.14	< 0.001
C²	3 625.19	1	3 625.19	665.36	< 0.001
残差	38.14	7	5.45
失拟项	20.21	3	6.74	1.50	0.342
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